l ELISPOT 圖像分析儀（ELISPOT Reader）發(fā)展簡史

要實現(xiàn)這個過程的自動化，我們很容易想到顯微照相技術(shù)、圖像處理技術(shù)以及計算機人工智能技術(shù)。把它們綜合到一起，這就是ELISPOT圖像分析儀。1992年，德國萊卡公司推出了第一臺ELISPOT圖像分析儀。正如上世紀60年代發(fā)明的第一臺計算機占地幾百平方米，且性能低下一樣。萊卡公司推出的第一代ELISPOT圖像分析儀，僅計算機就占據(jù)一張實驗臺的位置，數(shù)據(jù)采集部分使用了復(fù)雜的電視攝像系統(tǒng)。這臺儀器體積龐大，效率低下。在90年代初期，ELISPOT技術(shù)并未受到重視，因而ELISPOT圖像分析儀也沒有得到推廣。不到一年時間，萊卡公司就放棄了這一產(chǎn)品。1995年，隨著荷蘭Utrecht大學(xué)免疫研究所的Schielen P.（Schielen P et. al., 1995）首先引入PVDF膜到ELISPOT技術(shù)中，使得ELISPOT的可靠性和簡便性提高，ELISPOT技術(shù)逐漸受到重視，相應(yīng)的ELISPOT文獻大量涌現(xiàn)。眾多科研工作者迫切需要能夠自動讀ELISPOT板的設(shè)備，因此在1995年到1997年間，出現(xiàn)了數(shù)家生產(chǎn)ELISPOT圖像分析儀的廠家。

1995年出現(xiàn)的ELISPOT圖像分析儀廠家以德國卡爾蔡司公司，德國Bio-Sys公司，美國CTL公司，和德國AID公司為代表。對于如何識別PVDF膜板上的ELISPOT斑點，這些廠家分成兩派：1）德國卡爾蔡司公司和德國Bio-Sys公司。這兩家生產(chǎn)商延續(xù)了德國萊卡公司的思路，依然采用顯微攝像系統(tǒng)來識別ELISPOT斑點。這種思路保持了PVDF膜板的完整性，強調(diào)對每一個孔的準確定位。2)德國AID公司和美國CTL公司。由于PVDF膜板在構(gòu)造上的特殊性，PVDF膜與塑料板壁之間是可撕裂的。這兩家公司從而產(chǎn)生了新的思路：采用粘貼紙將PVDF膜粘附，再將其從塑料板壁上撕下。這樣就將識別在板上的ELISPOT斑點的問題變成了識別在平面上的ELISPOT斑點的問題。而識別平面上的ELISPOT斑點可以直接以掃描儀來進行。

在上個世紀90年代中期，通過掃描來進行ELISPOT斑點的識別是一個重要的技術(shù)進步。第一，掃描相對于攝像大大提高了分析速度；第二，掃描模式直接繞過了如何定位96孔板上的每一個孔的難題；第三，在價格上掃描系統(tǒng)只相當于攝像系統(tǒng)的三分之一或者更低，從而使得大多數(shù)實驗室都能夠購買ELISPOT圖像分析儀。但是基于掃描系統(tǒng)的ELISPOT圖像分析儀也有其固有的缺點。首先，掃描儀的分辨率非常低，隨著ELISPOT檢測方法應(yīng)用范圍迅速擴大，某些實驗中產(chǎn)生的ELISPOT斑點很小，掃描儀完全無法識別。雖然掃描儀本身的分辨率也在不斷提高，但和顯微攝像系統(tǒng)相比，始終要低1-2個數(shù)量級。其次，將PVDF膜板底部的PVDF膜撕下來掃描的做法是有其不妥之處：某些時候直接導(dǎo)致部分結(jié)果丟失，同時也不利于數(shù)據(jù)長期保存。第三，其應(yīng)用受限于以膜為底的ELISPOT板，當90年代末期，ELISPOT透明塑料板出現(xiàn)時，這種基于掃描的ELISPOT圖像分析儀在應(yīng)用上大大受阻。

在ELISPOT圖像分析儀的發(fā)展史上，90年代末期出現(xiàn)的數(shù)碼技術(shù)是重要的技術(shù)進步。數(shù)碼識別技術(shù)與計算機人工智能的結(jié)合使得體積小、功能強大的ELISPOT圖像分析儀成為可能。當數(shù)碼技術(shù)出現(xiàn)以后，德國AID公司和美國CTL公司迅速拋棄了其原有的基于掃描系統(tǒng)的ELISPOT圖像分析儀，重新投向以攝像系統(tǒng)為基礎(chǔ)的ELISPOT圖像分析儀。在今天的ELISPOT圖像分析儀市場上，ELISPOT掃描系統(tǒng)只剩下部分90年代的庫存產(chǎn)品。這就是技術(shù)進步的重大力量。

由于數(shù)碼識別技術(shù)的出現(xiàn)，始終堅持通過顯微攝像識別ELISPOT斑點這一技術(shù)路線的德國卡爾蔡司公司和德國Bio-Sys公司從此一直走在ELISPOT圖像分析儀市場的前端。在具體的技術(shù)路線上，兩家公司又略有不同。德國卡爾蔡司公司希望突出其高精密的顯微鏡頭，力求在成像上做到能夠識別PVDF膜上的每一個小的斑點。但是其缺陷也非常明顯：第一，要達到此目的，只能通過放大圖像來實現(xiàn)，這樣就不可能在一副圖像上包括整個完整孔底。卡爾蔡司公司通過軟件拼接的方法，將多幅放大圖像拼成一幅包括大部分孔底的圖像，從而實現(xiàn)對整個孔中的ELISPOT斑點進行計數(shù)。這樣的結(jié)果是：圖像出現(xiàn)明顯的拼接痕跡，同時，在拼接縫部分的斑點識別，以及在孔邊緣的斑點識別也都同時成為了亟待解決確又難以解決的問題。第二，更關(guān)鍵的是，由于ELISPOT實驗過程涉及細胞，細胞碎片、自發(fā)分泌、非特異分泌、顯色問題等多種情況，都會在PVDF膜上留下斑點或者花紋。因此，ELISPOT斑點識別的一個關(guān)鍵的問題是對真假斑點的識別。熟悉ELISPOT技術(shù)的實驗者都有共識，一個正常的ELISPOT斑點在大小上通常不會小于20μm。因此，關(guān)注于對小的斑點都能清晰識別，在生物學(xué)上并沒有太大的實際意義，反而因為增加了小斑點的識別影響了對真正的ELISPOT斑點的識別。第三，也是不可忽視的一點：卡爾蔡司公司的ELISPOT圖像分析儀是市場上價格昂貴的設(shè)備，是其他廠商同類型設(shè)備的兩倍以上！

l 德國ByoSys公司的Bio-Reader系列

德國Bio-Sys公司從上世紀80年代開始就致力于生物圖像識別領(lǐng)域，在進入ELISPOT圖像分析儀市場后一直以其先進的ELISPOT斑點識別技術(shù)聞名。德國Bio-Sys公司首先解決了顯微攝像系統(tǒng)難以定位96孔板上的每一個孔的問題。其解決方法基于圖像識別技術(shù)，利用板孔邊壁和真正的孔底的細微差別，在機械定位的基礎(chǔ)上，通過軟件識別來進一步提高每孔的定位精度。是目前市場上所有ELISPOT圖像分析儀中唯一能夠完整識別整個孔底ELISPOT斑點圖像的設(shè)備。在對真假斑點的分辨中，德國Bio-Sys公司除了具備完善的物理學(xué)多參數(shù)識別技術(shù)，還特別針對ELISPOT斑點形成的生物學(xué)過程，通過細胞因子顯色后的“光密度”峰值積分分析方法，精確分辨真假斑點、融合斑點等復(fù)雜情況。Bioreader系列ELISPOT圖像分析儀國外大多數(shù)較有經(jīng)驗的ELISPOT實驗室推崇的特點為：專業(yè)性和參數(shù)全開放性。因為ELISPOT實驗的復(fù)雜性，ELISPOT斑點形成在不同的實驗條件下有非常大的差異。這就對ELISPOT圖像分析儀提出了較高的要求：既要能夠保證斑點計數(shù)的真實性和一致性，又要能夠根據(jù)不同情況，通過實驗者的判斷來校正儀器對ELISPOT斑點識別的標準。要同時實現(xiàn)以上兩個要求，唯一的辦法是將儀器的所有判斷標準向ELISPOT實驗者開放，實現(xiàn)實驗者和儀器的互動。在這一方面，德國Bio-Sys公司始終走在ELISPOT斑點識別領(lǐng)域的前列，新的Bioreader-4000型（圖8.3）和Bioreader -5000（圖8.4） 型在專業(yè)性和適用性方面都領(lǐng)先于其他廠家的設(shè)備。

l ELISPOT 圖像分析儀的發(fā)展和展望

近幾年，ELISPOT圖像分析儀的應(yīng)用在向兩個方向發(fā)展。

第一， 作為斑點識別類型的儀器，ELISPOT圖像分析儀在努力地開辟在其它斑點識別領(lǐng)域的應(yīng)用。

在這個方面做的較好的是德國Bio-Sys公司的Bioreader系列。受惠于Bioreader在光源照明設(shè)計和軟件參數(shù)開放兩方面的優(yōu)點，德國Bio-Sys公司的ELISPOT圖像分析儀只需在參數(shù)上進行調(diào)整，就可以對6孔板、24孔板、96孔板等板型上的病毒斑、溶血空斑、腫瘤細胞克隆斑等實體斑點或者空斑點進行識別，大大擴展了儀器本身的應(yīng)用。

第二， 對雙色、多色、以及熒光FluoroSpot的識別。

隨著ELISPOT技術(shù)本身的發(fā)展，研究者不再滿足于現(xiàn)有的對單一細胞因子分泌所形成的ELISPOT斑點的識別。雙色或多色ELISPOT技術(shù)就此產(chǎn)生。簡而言之，雙色或多色ELISPOT即檢測同一細胞同時分泌兩種或以上的細胞因子的技術(shù)。舉個例子，如果以紅色顯色劑顯示IFN-γ的分泌，以藍色顯色劑顯示IL-2的分泌，在同一個孔中，就可以通過這兩個顯色系統(tǒng)分辨：有多少細胞只分泌IFN-γ（紅色斑點），只分泌IL-2（藍色斑點），和同時分泌這兩種細胞因子（棕色斑點）。

但是，原理上很簡單的雙色或多色ELISPOT技術(shù)在實際應(yīng)用中遇到了很大的困擾。這就是關(guān)于混色ELISPOT斑點的識別問題。具體到每個細胞，如果有兩個顯色系統(tǒng)同時顯色：部分紅色/部分藍色，以及其間的各種組合，都會導(dǎo)致不同的顏色；斑點的不同顯色區(qū)域，可能以紅色為主，也可能以藍色為主，無法均一定義；先分泌某種細胞因子，后分泌某種細胞因子，可能會產(chǎn)生覆蓋等諸多問題。這些問題都導(dǎo)致混色ELISPOT斑點難于識別。在這個方面，目前還沒有一個很好的解決辦法，從而也限制了雙色或多色ELISPOT技術(shù)的應(yīng)用。從實際使用中來看，有少部分科研工作者在使用雙色ELISPOT技術(shù)，通常為探索性的研究；而多色ELISPOT技術(shù)，幾乎沒有人使用。

與之相對應(yīng)，ELISPOT圖像分析儀在這個方面也只是具備基本的功能。大多數(shù)ELISPOT圖像分析儀采用RGB（紅、綠、藍）三色定義方案來識別多色斑點。RGB三色定義方案采用固定紅、綠、藍濾鏡，通過對一種顏色斑點的遮蓋來識別其他所有顏色斑點。從理論上講，在情況下多能夠識別三色斑點的ELISPOT。但實際應(yīng)用中，顯色系統(tǒng)的不同實驗條件會導(dǎo)致不同的顏色。比如：AEC顯色系統(tǒng)從理論上為標準紅色，但實際上根據(jù)實驗條件的不同，其顯色從橙黃到正紅到紫紅。其他顯色系統(tǒng)也有類似的問題。如果兩種或以上顯色系統(tǒng)共同作用，其混色斑點的顏色千變?nèi)f化，絕對不是簡單用紅、綠、藍三色固定濾鏡能夠分辨的。如何解決這個問題，只有在顏色定義方案上下功夫，在這個方面，德國Bio-Sys公司的顏色解決方案相對較好。德國Bio-Sys公司采用HLS（色度、亮度、飽和度）這一國際新的顏色定義方案，理論上可自定義十萬種以上顏色，用于濾鏡識別。在針對單色顯色系統(tǒng)和多色顯色系統(tǒng)因各種原因?qū)е路菢藴暑伾淖R別上相對準確。當然該系統(tǒng)也有其自身的不足：對于斑點與斑點之間、孔與孔之間、板與板之間的顏色變化，不能自動適應(yīng)，自動調(diào)節(jié)。對于顏色自動識別，這是一個普遍的難題，目前沒有一種技術(shù)能夠做到。

ELISPOT技術(shù)如果需要向多細胞因子檢測的方向發(fā)展，就必須解決多顯色系統(tǒng)同時顯色的問題。既然混色識別是一個難以跨越的難題，一些ELISPOT試劑生產(chǎn)商自然向熒光顯色方向發(fā)展，這就是熒光耦聯(lián)免疫斑點技術(shù)（FluoroSpot）。由于采用熒光發(fā)光標記，而不是顯色劑沉淀顯色，熒光耦聯(lián)免疫斑點（FluoroSpot）從誕生之日起，就天然的解決了多系統(tǒng)同時顯色的問題。同時由于熒光發(fā)射光波長具有唯一性，其顏色不因?qū)嶒灄l件的變化而變化。FluoroSpot從2005年出現(xiàn)以來，在敏感性、特異性等方面已經(jīng)達到或超過ELISPOT，目前更大的難題在于長期保存的問題，限制了其商業(yè)化進程。但是，F(xiàn)luoroSpot作為多細胞因子檢測的必然發(fā)展方向，已經(jīng)在ELISPOT領(lǐng)域的科學(xué)工作者中達到共識。與之相配合，熒光耦聯(lián)免疫斑點（FluoroSpot）圖像分析儀也在2005年底首先由德國Bio-Sys公司正式推出市場，并在加拿大實現(xiàn)全世界首臺FluoroSpot圖像分析儀的銷售和應(yīng)用。

我們可以預(yù)測，隨著FluoroSpot技術(shù)的成熟和FluoroSpot圖像分析儀的成熟，F(xiàn)luoroSpot必然逐漸取代目前的ELISPOT技術(shù)，并使得免疫斑點技術(shù)真正成為以高通量、多因子、高靈敏、和高穩(wěn)定性為特征的細胞免疫檢測技術(shù)。而免疫斑點圖像分析儀的不斷發(fā)展也大力地推動了該技術(shù)在免疫學(xué)、病毒學(xué)、腫瘤學(xué)、以及臨床檢測中的廣泛應(yīng)用。