流式細胞分析時，樣本細胞中一般都含有一定量的死細胞，通過一定的方法可以減少樣本中死細胞的比例，但是完全去除樣本中的死細胞幾乎是不可能的。但流式分析的目標為活細胞，因此流式分析時將死細胞當作活細胞來分析，會嚴重影響流式分析的結(jié)果，通常可以選擇熒光染料來標記區(qū)分死活細胞的方法，下面介紹一些流式分析時區(qū)分死細胞和活細胞的簡單方法。

（1）對角線死細胞

通常都悉知對角線可以區(qū)分死細胞，那么為什么死細胞會聚集在對角線上呢？原因是死細胞也可以產(chǎn)生非特異性熒光，而且死細胞產(chǎn)生的非特異性的熒光要明顯強于活細胞，甚至強于熒光素產(chǎn)生的熒光信號。非特異性熒光的波長是沒有選擇性的，不局限于某一波長范圍，所以一般所有常用的熒光信號通道都能夠接收到死細胞產(chǎn)生的非特異性熒光信號，而且該信號在所有波長范圍的熒光強度相差不多，各個熒光通道接收到的熒光強度都是處于同一個等級的。因此，在散點圖上死細胞是位于對角線上的，而且不同的死細胞，其非特異性熒光的強度不同，并且差異性強度很大，所以從整體來看，死細胞的非特異性熒光強度呈現(xiàn)從低到高的連續(xù)性分布，表現(xiàn)在散點圖上死細胞剛好處于對角線上，如圖1-A所示呈線性，與活細胞群體的圓形分布有明顯的區(qū)別，因此我們可以根據(jù)死細胞這一特性區(qū)分活細胞和死細胞。

圖1：對角線死細胞流式圖（來源于《流式細胞術(shù)》）

雖然死細胞位于散點圖的對角線上，但是對角線上的細胞確不一定是死細胞，因為雙陽性細胞如果在x軸和y軸的熒光信號相似時，也可以位于對角線上。所以，散點圖對角線上的細胞可能是死細胞，也可能是雙陽性細胞。如圖1-B所示，樣本細胞為正常小鼠脾臟細胞，標記 FITC-抗CD3抗體和PE-抗CD4抗體，F(xiàn)ITC和PE雙陽性的CD4 T細胞和死細胞混在一起，無法區(qū)分。但是死細胞和雙陽性細胞的形狀是不一樣的，死細胞呈現(xiàn)連續(xù)的線型分布，而雙陽性細胞群呈現(xiàn)圓形的群體分布，因此，可以從對角線上的細胞群體的形狀大致判斷細胞的性質(zhì)。雖然不能根據(jù)熒光強度的強弱來區(qū)分該熒光信號是來自于死細胞的非特異性熒光還是來自熒光素產(chǎn)生的熒光，但是可以利用在散點圖上死細胞位于對角線的特點來區(qū)分死細胞和陽性活細胞。如圖1-C所示，x軸表示FITC通道（樣本細胞標記有FITC-抗CD3抗體），y軸表示APC通道（閑置通道），借用該散點圖可以明確區(qū)分圖1-B中無法區(qū)分的死細胞和雙陽性細胞。此時只需要將排除了死細胞后的CD3 T細胞設(shè)門，將門內(nèi)的細胞顯示于新的FITC-PE散點圖中，如圖1-D，此時該散點圖內(nèi)的細胞都是活細胞，因為樣本細胞同時標記有PE-抗CD4抗體，所以圖中的細胞明顯分為兩群，雙陽性的是CD4T細胞，單陽性的是CD8 T細胞。

（2）PE-Cy5通道非標記陽性細胞

PE-Cy5通道（通常是FL3，接收的熒光波長范圍大致為655-685nm）有時可用于識別死細胞，但首先該通道必須是閑置的通道，及樣本細胞中沒有標記該通道代表的熒光素（PE-Cy5、PerCP等）偶聯(lián)抗體。選擇PE-Cy5-SSC散點圖，一般可看到不成群的PE-Cy5陽性細胞，這些陽性細胞的SSC值也是散在分布的，這些散在的PE-Cy5通道非標記陽性細胞，即圖2-A中的紅色部分，將這部分細胞設(shè)門顯示于FITC-PE散點圖中，如圖2-B所示，這部分PE-Cy5通道非標記陽性細胞基本都位于對角線部分，而對角線細胞一般為死細胞，所以散在的PE-Cy5通道非標記陽性細胞一般就是死細胞。

圖2 PE-Cy5通道非標記的陽性細胞（來源于《流式細胞術(shù)》）

因此利用PE-Cy5通道非標記陽性細胞區(qū)分活細胞和死細胞時，可以先在FSC-SSC圖中選擇目標所在的細胞群，將其設(shè)門，然后將門內(nèi)的細胞顯示于PE-Cy5-SSC散點圖中，排除PE-Cy5通道非標記陽性細胞代表的死細胞，將PE-Cy5陰性細胞設(shè)門，然后將門內(nèi)的細胞顯示于新的流式圖內(nèi)分析，這是該流式圖內(nèi)的細胞都是活細胞，分析或者分選時就可以盡量排除死細胞的干擾了。

以上兩種排除死細胞的方法只是一種經(jīng)驗的方法，一般在實驗要求不高或者預(yù)實驗時使用，流式分析時可以借鑒這兩種方法區(qū)分死細胞和活細胞，但是不能將這兩種方法作為區(qū)分死細胞和活細胞的標準方法，使用死活細胞染料，例如常見的7-AAD，PI和Zombie Dyes系列等才是標記死活細胞的正確方法。

(3) 7-AAD、PI標記死細胞

7-AAD（7氨基放線菌素D）與PI（碘化丙啶）是經(jīng)典的核酸標記染料，在流式細胞術(shù)中能夠用于標記死細胞，以排除死細胞對實驗結(jié)果的干擾。7-AAD的熒光信號被PerCP通道接收，所以7-AAD不能與PerCP或PE-Cy5偶聯(lián)的抗體共同標記樣本細胞。但其發(fā)射的熒光波長基本不與PE發(fā)射的熒光重疊，因此可以與和PE共同標記樣本細胞。而PI染料被激發(fā)后發(fā)射的熒光波譜范圍很大，常規(guī)FL2、FL3都能接收到其熒光信號，并且與PE、PerCP、PE/Cy5熒光素發(fā)射的熒光波長有很大程度的重疊，因此PI染料不宜與這些染料共標記。

7-AAD、PerCP、PE、PI、PE/Cy5發(fā)射光譜： 

（4）Zombie Dyes標記死細胞

當流式檢測只分析細胞表面抗原分子，且不對樣本固定時，7-AAD和PI是比較理想和經(jīng)典的方法。但是如果需要分析細胞內(nèi)的分子，如檢測胞內(nèi)細胞因子、胞內(nèi)活化的激酶和核內(nèi)分子等需要固定樣本細胞，在胞膜上打孔，使熒光素偶聯(lián)抗體能夠通過細胞膜進入細胞內(nèi)，與相應(yīng)目標分子結(jié)合，這時7-AAD與PI就無法鑒別死細胞和活細胞了。

圖為：體外培養(yǎng)一天的C57BL/6小鼠脾細胞做Annexin V/PI染色的流式數(shù)據(jù)。其中，左邊為未經(jīng)固定處理的細胞上機檢測結(jié)果；右邊為經(jīng)過70%EtOH, 1.5%PFA固定處理的細胞上機檢測結(jié)果。

圖為：體外培養(yǎng)一天的C57BL/6小鼠脾細胞做Annexin V/7-AAD染色的流式數(shù)據(jù)。其中，左邊為未經(jīng)固定處理的細胞上機檢測結(jié)果； 右邊為經(jīng)過70%EtOH, 1.5%PFA固定處理的細胞上機檢測結(jié)果。

Zombie Dyes有別于PI和7-AAD等DNA染料，它是一種可用于需固定細胞實驗的染料，通過與細胞上蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合來實現(xiàn)。因活細胞可排除染料，所以僅細胞膜被著色；而死細胞的細胞膜及細胞質(zhì)均被著色，繼而根據(jù)熒光信號的強弱來區(qū)分死/活細胞。而且Zombie Dyes可選擇性多，可以由不同的激發(fā)光激發(fā)，便于靈活選擇。

相關(guān)數(shù)據(jù)：

Zombie Dyes的發(fā)射光譜：

相關(guān)產(chǎn)品：